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牛痘病毒加帽酶 (10 KU/mL)說明書
真核生物中mRNA經(jīng)轉錄后修飾在5'端形成一個特殊結構，即帽子結構，該結構對mRNA的穩(wěn)定、轉運與翻譯過程均有較重要作用。牛痘病毒加帽酶是催化形成帽子結構的有效酶，其由D1和D12兩個亞基組成，兼具RNA三磷酸酯酶活性、鳥苷?；D移酶活性和鳥嘌呤甲基轉移酶活性，可將7-甲基鳥嘌呤帽結構（m7Gppp）連接到RNA的5'末端（m7Gppp5'N）。牛痘病毒加帽酶，在合適濃度的加帽緩沖液（Capping buffer），鳥苷三磷酸（GTP），S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等存在條件下，能夠在一個小時之內(nèi)對RNA進行加帽，并且保證正確的方向。
本品以無菌液體形式提供，可應用于體內(nèi)/體外翻譯前mRNA的加帽反應或mRNA的5'末端標記反應。
產(chǎn)品組分
組分名稱 | 產(chǎn)品編碼/規(guī)格 | ||
78MRNA-1105A（500 U） | 78MRNA-1105B（2000 U） | 78MRNA-1105C（10000 U） | |
10×Capping Buffer | 150 ul | 500 ul | 1.25 mL×2 |
SAM(32mM) | 50 ul | 200 ul | 1 ml |
RNase free water | 1ml | 1ml | 1mlx3 |
Vaccinia Virus Capping Enzyme (10 U/μL) | 50 ul | 200 ul | 1 mL |
產(chǎn)品性質
來源（Source） | 攜帶牛痘病毒加帽酶基因的E. coli |
最適溫度（Optimum Temperature） | 37℃ |
儲存緩沖液（Storage Buffer） | 20 mM Tris-HCl pH 8.0，100 mM NaCl，1 mM DTT，0.1 mM EDTA，0.1% Triton X-100，50%甘油 |
活性單位定義（Unit Definition） | 37℃條件下，1小時內(nèi)將10 pmol GTP（α- 32P）摻入到一條含80個核苷酸（80 nt）轉錄產(chǎn)物上所需要的酶量，即為1個單位。 |
產(chǎn)品應用【 加帽反應 】適用于10 μg RNA（≥100 nt）的加帽反應，反應體系20 μL，且可根據(jù)實驗需要放大。1. 取10 μg RNA，用RNase free water將適量RNA稀釋至15 μL；2. 將RNA置于65℃加熱5 min，結束后冰上放置5 min；3. 按照右側表格依次加入各組分；4. 37℃反應30 min；5. RNA加帽完成，可進行后續(xù)實驗。
| 組分 | 體積 |
| Denatured RNA | 15 ul |
| 10×Capping Reaction Buffer | 2 ul |
| GTP (10 mM) | 1 ul |
| SAM (2 mM) | 1 ul |
| Vaccinia Capping Enzyme (10 U/μL) | 1 ul |
| Total volume | 20ul |
【 5′ 末端標記反應 】本步驟適用于 5′末端帶有三磷酸的RNA標記，且可根據(jù)實驗需要放大。其標記效率受反應體系中RNA與GTP摩爾濃度比以及RNA樣本中GTP含量影響。1. 用RNase Free Water將適量RNA稀釋至14 μL；2. 將RNA置于65℃加熱5 min，結束后冰上放置5 min；3. 按照右側表格依次加入各組分；4. 37℃孵育30 min；5. RNA 5′末端標記完成，可進行后續(xù)實驗。
| 組分 | 體積 |
| Denatured RNA | 14 ul |
| 10×Capping Reaction Buffer | 2 ul |
| GTP Mix | 2 ul |
| SAM (2 mM) | 1 ul |
| Vaccinia Capping Enzyme (10 U/μL) | 1 ul |
| Total volume | 20 ul |
*注：GTP Mix為GTP和少量標記物，GTP儲液應稀釋為反應體系中mRNA摩爾濃度的1~3倍。 注意事項：（1）用于加帽反應的RNA在使用前應進行純化并溶解于RNase free water 。溶液中不能含有EDTA和鹽。（2）加帽酶反應前加熱RNA可以去除轉錄產(chǎn)物5′的二級結構。如果轉錄產(chǎn)物的5′端結構復雜，可將加熱時間延長至10 min。（3）如果轉錄產(chǎn)物的5′端結構復雜，為提高加帽效率可將反應時間延長至120 min。（4）SAM在室溫下會逐漸降解，SAM降解會導致N 7 甲基化效率降低，會進一步導致加帽失敗，因此需始終放置在冰上。此外，也可以通過體系優(yōu)化適當提高用量以保證加帽反應順利進行。 其他用途可參考上述用途或相關文獻資料進行實驗
運輸和保存方法
干冰運輸。-20 oC保存，避免反復凍融，有效期1年。
注意事項
1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作；
2. 所提取的RNA需經(jīng)過純化并使用無核酸酶的水重懸；
3. 在加入酶之前需要對RNA溶液進行加熱以去除5'末端的二級結構；
4. 對于已知5'末端結構的RNA，可以延長反應時間至60分鐘，提高加帽效率；
5. 5'末端標記反應體系中，GTP儲液應稀釋為反應體系中mRNA摩爾濃度的1-3倍。
| 貨號 | 品名 | 規(guī)格 | 品牌 |
| 78MRNA-1105A | 牛痘病毒加帽酶 (10 KU/mL) | 500 U | BIOHUB |
| 78MRNA-1105B | 牛痘病毒加帽酶 (10 KU/mL) | 2000 U | BIOHUB |
| 78MRNA-1105C | 牛痘病毒加帽酶 (10 KU/mL) | 10000 U | BIOHUB |
