使用方法

1. 執(zhí)行常規(guī)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜和Western Blot步驟。注意用HRP標(biāo)記lgG或用一抗-鏈親和素-生物素-HRP夾法。

 注：優(yōu)化抗原和抗體的濃度。必須使用建議的抗體稀釋度，以保證陽性結(jié)果。

1) 將一抗?jié)舛认♂尩?.05～1ug/ml

2) 將二抗?jié)舛认♂尩?.005～0.04ug/mL

3) 將兩種底物組份按1:1比例混合，制備底物工作液。

注：暴漏于日光或任何其他強(qiáng)光可能損害工作液，為獲得最佳結(jié)果，將此工作液保存在琥珀色瓶中，并避免長期暴漏于任何強(qiáng)光。短時(shí)間暴漏于實(shí)驗(yàn)室常規(guī)照明不會(huì)損害該工作液。

4) 將印跡膜在ECL底物工作液中孵育5分鐘。

5) 吸出多余試劑。用清潔的塑料膜蓋住該印跡膜。

6)  使印跡膜在X光膠片上曝光。

2. Western Blot最后一次洗膜的同時(shí)新鮮配制發(fā)光工作液：分別取等體積的溶液A和B，放入干凈容器中混合。建議立即使用工作液，室溫放置數(shù)小時(shí)后仍可使用但靈敏度略有降低。

3. 用鑷子取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液但勿使膜干燥。將膜浸入發(fā)光工作液（0.125mL發(fā)光工作液/cm2膜）中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3分鐘，準(zhǔn)備立即壓片曝光。孵育時(shí)間過長不會(huì)增加靈敏度，有時(shí)還會(huì)導(dǎo)致曝光條帶異常。發(fā)光過程的本質(zhì)是酶促反應(yīng)，使用過少的發(fā)光工作液不利反應(yīng)進(jìn)行，也會(huì)導(dǎo)致膜上條帶曝光不均和明顯降低靈敏度。為達(dá)節(jié)約目的可將膜剪小但勿降低發(fā)光液用量。

4. 用鑷子夾起膜，搭在濾紙上瀝干發(fā)光工作液。但勿洗去發(fā)光液。

5. 打開X光膠片暗盒，在暗盒內(nèi)表面鋪一張面積大于膜的保鮮膜。將Western Blot膜貼在保鮮膜上，將保鮮膜折起來包裹Western Blot膜，去除氣泡和皺褶，可剪去邊緣部多余的保鮮膜。用濾紙吸去多余的發(fā)光工作液。用膠帶將覆蓋Western Blot膜的保鮮膜固定在暗盒內(nèi)，蛋白帶面向上。

6. 暗房內(nèi)壓X光膠片，分別曝光不同的時(shí)間如數(shù)秒到數(shù)分鐘。顯影沖洗。      

注意事項(xiàng)

（1）步驟1～5可在日光燈下操作；但發(fā)光液曝露于強(qiáng)光下時(shí)間過久靈敏度可能略有降低，移到暗房操作可避免之。戴手套可以避免在膜上留下手印。

（2）長時(shí)間曝光或蛋白過量，將加深背景并使條帶強(qiáng)弱變化失去線性關(guān)系。曝光不足則條帶模糊。

（3）發(fā)光工作液孵育約3分鐘后膜上的條帶發(fā)光。強(qiáng)條帶發(fā)光在暗房中肉眼可見，低豐度蛋白條帶發(fā)光較弱甚至肉眼不可見但可使X光膠片曝光。不能簡單以肉眼觀察判斷條帶發(fā)光時(shí)間。肉眼不可見的熒光實(shí)際上可持續(xù)數(shù)小時(shí)并使X光膠片感光，因而弱帶可曝光1-10小時(shí)。如果曝光后條帶不佳，可用洗膜緩沖液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用ECL發(fā)光和曝光。

（4）由于超敏發(fā)光液極其靈敏，強(qiáng)烈推薦大多數(shù)進(jìn)口抗體起始濃度為一抗1:1000～1:4000，二抗1:2000～1:5000。抗體濃度過高將造成高背景或沒有條帶，導(dǎo)致失敗。

（5）某些保鮮膜包裹印跡膜時(shí)可能會(huì)淬滅熒光，應(yīng)選擇高質(zhì)量保鮮膜。

（6）使用肉眼可見的預(yù)染色蛋白Marker和熒光-放射自顯影曝光標(biāo)簽可精確確定膠片上條帶的位置和大小。

（7）NaN3能抑制HRP活性，回收第二抗體應(yīng)避免使用NaN3，如必需使用勿超過0.01%。 

（8） 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

（9） 本產(chǎn)品主要用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。