手把手教你做出RT-qPCR最美曲線系列：如何正確選擇逆轉(zhuǎn)錄引物？

更新時(shí)間：2023-08-24 點(diǎn)擊次數(shù)：664

1. Oligo（dT）

Oligo(dT)是多聚胸腺嘧啶、T重復(fù)寡核苷酸，就是只有胸腺嘧啶組成的核苷酸鏈。因?yàn)镺ligo(dT)與mRNA的Poly(A)尾巴可以發(fā)生特異性結(jié)合，所以用Oligo(dT)特異結(jié)合到mRNA上Poly(A)尾端，因此，主要用于逆轉(zhuǎn)帶有Poly(A)尾的mRNA。例如模板為真核生物來(lái)源，Oligo(dT)可與mRNA的3’Poly(A)尾配對(duì)，有利于長(zhǎng)鏈或全長(zhǎng)mRNA的逆轉(zhuǎn)錄。但是，其對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不允許其降解，否則全長(zhǎng)cDNA合成量會(huì)大量減少。

2. 隨機(jī)引物

隨機(jī)引物是指當(dāng)特定mRNA由于含有使逆轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而難于拷貝其全長(zhǎng)序列時(shí)，可采用隨機(jī)六聚體這一不特異的引物來(lái)拷貝全長(zhǎng)mRNA，一般6到8個(gè)堿基，許多隨機(jī)引物組成一套引物組。它可用于mRNA、rRNA、tRNA等各種RNA的逆轉(zhuǎn)錄，對(duì)于目標(biāo)區(qū)域具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)/GC含量較高，或者來(lái)源為原核生物的模板也同樣適應(yīng)。

3. 基因特異性引物

基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)的。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。通常特異性引物用于一步RT-qPCR實(shí)驗(yàn)中。

PART 02

逆轉(zhuǎn)錄引物優(yōu)劣勢(shì)比較

引物類型	結(jié)合部位	優(yōu)點(diǎn)	缺點(diǎn)
Oligo(dT)	真核生物mRNA3’端poly(A)尾	可合成全長(zhǎng)cDNA	1、僅擴(kuò)增有polyA尾的mRNA 2、對(duì)模板質(zhì)量要求高
隨機(jī)引物	RNA的許多隨機(jī)可結(jié)合部位	適合復(fù)雜結(jié)構(gòu)和微量模板	特異性低，小片段多
基因特異性引物	特異性互補(bǔ)序列	特異性強(qiáng)，靈敏度高	僅合成特定的序列

PART 03

逆轉(zhuǎn)錄引物的選擇

RNA類型：

1、真核生物mRNA

2、miRNA、核糖體RNA和tRNA等小RNA前體加A尾處理后的模板

引物選擇：

Oligo(dT)

原因：

1、真核生物mRNA含有poly(A)尾，可以O(shè)ligo(dT)引物結(jié)合

2、miRNA、rRNA和tRNA本身無(wú)A尾，故需要人工處理后才能與Oligo(dT)引物結(jié)合

RNA類型：

1、rRNA、tRNA、原核生物mRNA等無(wú)3’端poly(A)尾的模板

2、長(zhǎng)度比較長(zhǎng)、有二級(jí)結(jié)構(gòu)存在及微量樣本的模板

引物選擇：

隨機(jī)引物

原因：

隨機(jī)引物可以在任意位點(diǎn)和RNA結(jié)合并開(kāi)始反轉(zhuǎn)

RNA類型：

1、已知基因序列的模板

2、miRNA增加莖環(huán)結(jié)構(gòu)的模板

引物選擇：

基因特異性引物

原因：

1、針對(duì)特定序列設(shè)計(jì)的反轉(zhuǎn)錄引物

2、miRNA（莖環(huán)法）的反轉(zhuǎn)錄，需要根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的引物

【注】:為提高反轉(zhuǎn)錄效率，并保障獲得更加完整的cDNA，建議將Oligo(dT)和隨機(jī)引物混合使用。

PART 04

精品推薦

RNA類型	引物選擇	原因
1、真核生物mRNA 2、miRNA、核糖體RNA和tRNA等小RNA前體加A尾處理后的模板	Oligo(dT)	1、真核生物mRNA含有poly(A)尾，可以O(shè)ligo(dT)引物結(jié)合 2、miRNA、rRNA和tRNA本身無(wú)A尾，故需要人工處理后才能與Oligo(dT)引物結(jié)合
1、rRNA、tRNA、原核生物mRNA等無(wú)3’端poly(A)尾的模板 2、長(zhǎng)度比較長(zhǎng)、有二級(jí)結(jié)構(gòu)存在及微量樣本的模板	隨機(jī)引物	隨機(jī)引物可以在任意位點(diǎn)和RNA結(jié)合并開(kāi)始反轉(zhuǎn)。
1、已知基因序列的模板 2、miRNA增加莖環(huán)結(jié)構(gòu)的模板	基因特異性引物	1、針對(duì)特定序列設(shè)計(jì)的反轉(zhuǎn)錄引物 2、miRNA（莖環(huán)法）的反轉(zhuǎn)錄，需要根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的引物

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